Окраска по Граму

Немного истории

Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.

Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.

Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.

Грам был скромным человеком и в своей первой публикации отметил, "И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное."         В настоящее время известно много модификаций окраски по Граму.

Теория

Окраска по Граму основана на различиях в строении клеточной стенки прокариот. Грамположительные бактерии имеют толстую, прочную, просто устроенную стенку (толщина более 50 нм)   Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин), построенный их остатком N-ацетил мурамовой кислоты. Прочность линейному полимеру придают поперечные тетрапептидные сшивки, соединяющие отдельные слои пептидогликана. С петидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые или  липотейхоевые кислоты (от греч. teichos - стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола  и рибитола, соединенных фосфатными мостиками.  Молекулы тейхоевых кислот являются рецепторами адгезии (адгезинами), специфическими антигенами многих бактерий.  С пептидогликаном могут быть связаны белки (А, М, Т, R и др.), которые располагаются снаружи также кластерами.  Эти белки являются антифагинами, репелентами фагоцитоза, рецепторами для антител. 

Грамотрицательные бактерии содержат очень небольшое количество пептидогликана, не имеющего поперечных сшивок. Над слоем муреина располагается периплазматическое пространство, играющее важную роль в обменных процесса (периплазматические ферменты) Далее располагается наружная мембрана, которая имеет строение, характерное для биологических мембран.  Внешний листок наружной мембраны содержит липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, стержневой (базисной) части, или ядра,  и полисахаридной цепи, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями. 

Основной краситель интенсивно связывается муреиновым слоем. Поскольку этот слой у грамотрицательных бактерий очень тонкий и экранируется внешней мембраной, эти микроорганизмы сорбируют значительно меньше красителя, чем грамположительные. 

Йод образует с красителем и муреином сложный комплекс, который труднее вымывается обесцвечивающими растворами. Дифференцирующие растворы вымывают весь краситель из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в то время, как грамположительные еще содержат достаточное количество красителя. 

Дополнительный краситель докрашивает обесцвеченные грамотрицательные бактерии в контрастный цвет.

Варианты окраски

"Классический" метод