Стандарт мутности

Теория

При проведении различных бактериологических исследований часто возникает необходимость приготовить инокулюм, содержащий определенное количество микробных клеток (вернее сказать - колониеобразующих единиц, КОЕ). Для этого готовят серию последовательных разведений исходной суспензии. Концентрацию клеток в ней оценивают, сравнивая ее мутность с контрольным эталоном.

Первоначально эталон готовили из взвеси Salmonella typhi, инактивированных 2% формалином или прогреванием при 60 0С в течение 1,5 часов и законсервированных добавлением 0,5% фенола. Однако, бактериальные эталоны мутности очень нестабильны при хранении и им на смену пришел стеклянный международный эталон.

Стандарт мутности (син.: международный стандарт мутности, стеклянный стандарт мутности), утвержденный Всемирной организацией здравоохранения первичный эталон мутности для оптической стандартизации бактериальных взвесей, соответствующий мутности взвеси бактерий Борде — Жангу, содержащей 1010 клеток в 1 мл, т.е. равный 10 единицам мутности; представляет собой взвесь частиц стекла пирекс (5th International Reference Preparation of Opacity, 10 МЕ (5th IRP, 76/522)). В нашей стране такой эталон выпускают:

  • ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России  - Отраслевой стандарт мутности 42-28-85 (10 МЕ) и 42-28-86 (5 МЕ)
  • ООО "ОРМЕТ"  - Стандартные образцы мутности бактерийных взвесей (набор БАК-5 и БАК-10), СОП 1-98-15

Указанные стандартные образцы изготавливаются из частиц стекла марки "Pyrex" размером 0,5 - 3,0 мкм и очищенной воды. Взвесь этого стекла химически устойчива, не коагулирует при седиментации частиц, при взбалтывании осадка образует взвесь исходной дисперсности и мутности. Взвесь не выдерживает замораживания. Срок годности стандартного образца - 12 месяцев. Мутность стандарта на 10 единиц соответствует следующей концентрации микроорганизмов:


Микроорганизм (группа)ОСО 42-28-85, КОЕ/млСО БАП-10, КОЕ/мл
Entherobacteriaceae0.85x1090.93x109
Escherichia coli
1.11x109
Pseudomonas aeruginosa
1.20x109
Bordetella pertussis10.00x10911.00x109
Staphylococcus aureus
1.10x109
Brucella spp.1.50x1091.70x109
Vibrio cholerae2.00x1092.20x109
Francisella tularensis4.50x1095.00x109
Bacilus cereus
0.04x109


Хотя стеклянный стандарт официально является международным, наиболее широкое распространение в лабораторной практике получил стандарт McFarland на основе хлорида бария. Предложенный Джозефом Макфарландом в 1907 году, этот эталон указан практически во всех  нормативных документах, включая стандарты серий DIN, ISO, EN.

Шкала McFarland охватывает диапазон от 1,0 · 108 КОЕ/мл до 3,0 · 109 КОЕ/мл (0,5 - 10 Ед). Ведущие микробиологические фирмы производят стандарты, наиболее часто применяемые в лабораториях в повседневной работе, однако, в настоящее время они используют шкалу McFarland, но не его технологию. Современные фирменные стандарты мутности не содержат солей бария. Они готовятся из латексных микрочастиц, которые стабилизируются в жидкой фазе. Такие стандарты имеют срок годности всего 6 месяцев, что абсолютно не понятно, поскольку у автора этих строк есть стандарт мутности, который соответствует всем требованиям и через 15 лет после истечения срока годности.

Приготовление стандарта мутности

Для получения наиболее широко используемого стандарта McFarland 0,5 Ед смешивают 0,5 мл 1,175% (вес/объем) взвеси двухводного хлорида бария (BaCl2·2H2O) и 99,5 мл 1% (объем/объем) серной кислоты (H2SO4). Полученную взвесь разливают по 5-6 мл в пробирки, идентичные тем, в которых будет готовиться взвесь бактерий, и тщательно закрывают пробками, герметизируя их при помощи пленки типа «Parafilm» или другим способом, предупреждающим испарение жидкости. Такой стандарт мутности может храниться до 6 месяцев в темноте при комнатной температуре (22-250С). На пробирки со стандартами необходимо нанести специальные метки, позволяющие контролировать постоянство объема жидкости. Перед применением стандарт мутности необходимо интенсивно встряхнуть для получения равномерной взвеси хлорида бария. Состав различных вариантов стандарта McFarland приведен в таблице

 Состав стандарта мутности McFarland

McFarland Standard No.0.51234
BaCl2·2H2O 1,175%0,5 ml0,1 ml0,2 ml0,3 ml0,4 ml
H2SO4 1%99,5 ml9,9 ml9,8 ml9,7 ml9,6 ml
Концентрация бактерий1,0 × 1083,0 × 1086,0 × 1089,0 × 1081,2 × 109
Пропускание (%)*74.355.635.626.421.5
Поглощение*0.1320.2570.4510.5820.669


Контроль стандарта мутности

Для быстрого контроля можно использовать спектрофотометр или нефелометр с длиной волны 600 нм и с кюветой 1 см . Определение пропускания или поглощения света позволяет достаточно точно оценить качество приготовленного эталона.

Альтернативным методом контроля является мерный посев на неселективную среду из разведений контрольного штамма (например E.coli)


 Приборы для стандартизации бактериальной суспензии

 Каким бы хорошим ни был стандарт мутности, получаемый результат будет очень сильно зависеть от опыта оператора. Кроме того, на качестве будет сказываться множество факторов: качество освещения, усталость или плохое самочувствие оператора и т.п.  

В настоящее время доступны приборы, позволяющие облегчить эту процедуру. Примером такого прибора является "Densi-La-Meter II" (Эрба-Лахема). Это простой оптический прибор, работающий по принципу денситометра. Измеренные показания переводятся в единицы мутности по McFarland (0,3 - 10 Ед). Возможность пользовательской калибровки удобна, поскольку позволяет использовать любые пробирки (диаметром от 15 до 18,5 мм). Особенностью этого прибора является то, что во время измерения пробирка поворачивается и производится 5 замеров, данные которых, усредняются, что позволяет уменьшить вероятность ошибки, связанной с царапиной на пробирке, пылинкой и т.п.


398 17.07.2020