Поставка медицинского оборудования и расходных материалов

Окраска по Граму

Немного истории

Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.

Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.

Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.

Грам был скромным человеком и в своей первой публикации отметил, "И таким образом я публикую метод, несмотря на то, что знаю что сейчас он имеет недостатки и несовершенен; но я также надеюсь что в руках других исследователей он превратится во что-то полезное."         В настоящее время известно много модификаций окраски по Граму.

Теория

Окраска по Граму основана на различиях в строении клеточной стенки прокариот. Грамположительные бактерии имеют толстую, прочную, просто устроенную стенку (толщина более 50 нм)   Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин), построенный их остатком N-ацетил мурамовой кислоты. Прочность линейному полимеру придают поперечные тетрапептидные сшивки, соединяющие отдельные слои пептидогликана. С петидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые или  липотейхоевые кислоты (от греч. teichos - стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола  и рибитола, соединенных фосфатными мостиками.  Молекулы тейхоевых кислот являются рецепторами адгезии (адгезинами), специфическими антигенами многих бактерий.  С пептидогликаном могут быть связаны белки (А, М, Т, R и др.), которые располагаются снаружи также кластерами.  Эти белки являются антифагинами, репелентами фагоцитоза, рецепторами для антител. 

Грамотрицательные бактерии содержат очень небольшое количество пептидогликана, не имеющего поперечных сшивок. Над слоем муреина располагается периплазматическое пространство, играющее важную роль в обменных процесса (периплазматические ферменты) Далее располагается наружная мембрана, которая имеет строение, характерное для биологических мембран.  Внешний листок наружной мембраны содержит липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, стержневой (базисной) части, или ядра,  и полисахаридной цепи, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями. 

Основной краситель интенсивно связывается муреиновым слоем. Поскольку этот слой у грамотрицательных бактерий очень тонкий и экранируется внешней мембраной, эти микроорганизмы сорбируют значительно меньше красителя, чем грамположительные. 

Йод образует с красителем и муреином сложный комплекс, который труднее вымывается обесцвечивающими растворами. Дифференцирующие растворы вымывают весь краситель из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в то время, как грамположительные еще содержат достаточное количество красителя. 

Дополнительный краситель докрашивает обесцвеченные грамотрицательные бактерии в контрастный цвет.

Варианты окраски

"Классический" метод

Красители и реактивы

Основной краситель

  •    - Кристалл-виолет - 2,0 г
  •    - 96% этанол - 10,0 мл
  •    - 1% водный раствор фенола - 100 мл

Протравливающий раствор

  •    - Йод кристаллический - 1,0 г
  •    - Калия йодид - 2,0 г
  •    - Вода дистиллированная 300,0 мл

  1. Смешать в ступке кристаллический йод и калия йодид.
  2. Тщательно растереть пестиком.
  3. Добавлять по каплям воду, продолжая растирать смесь до кашицеобразного состояния.
  4. Постепенно добавить оставшуюся воду. Раствор хранить в банке темного стекла с притертой пробкой.

Дополнительный краситель

Нейтральный красный

  •    - Нейтральный красный - 1,0 г
  •    - Дистиллированная вода - 100,0 мл

или

Водный фуксин

  •    - Карболовый фуксин Циля - 5,0 мл
  •    - Дистиллированная вода - 95,0 мл


Методика окраски

1. На фиксированный мазок положить кусочек фильтровальной бумаги и нанести с избытком основной краситель (1-2 мин)
2. Слить краситель, промыть препарат водой, нанести раствор Люголя. (1-2 мин)
3. Слить раствор Люголя, препарат поместить в спирт (или налить спирт на препарат). (30-60 сек)
4. Тщательно промыть дистиллированной водой.
5. Докрасить одним из дополнительных красителей. (1-2 мин)
6. Промыть и подсушить препарат


Модификация Hucker

Красители и реактивы 

Основной краситель

РАСТВОР А

ИнгредиентыКол-во
Кристалл-виолет2,0 г
95% этанол20,0 мл

РАСТВОР B

ИнгредиентыКол-во
Цитрат аммония0,8 г
Дистиллированная вода80,0 мл


1. Смешать растворы А и В
2. Выдержать в течение ночи
3. Фильтровать через грубый фильтр перед использованием


Протравливающий раствор

  •    - Йод кристаллический - 1,0 г
  •    - Калия йодид - 2,0 г
  •    - Вода дистиллированная 300,0 мл

  1. Смешать в ступке кристаллический йод и калия йодид.
  2. Тщательно растереть пестиком.
  3. Добавлять по каплям воду, продолжая растирать смесь до кашицеобразного состояния.
  4. Постепенно добавить оставшуюся воду. Раствор хранить в банке темного стекла с притертой пробкой.

Дополнительный краситель

Сафранин

Концентрированный раствор
ИнгредиентыКол-во
Сафранин-О2,5 г
95% этанол100,0 мл
Рабочий раствор
ИнгредиентыКол-во
Концентрированный раствор10,0 мл
Дистиллированная вода90,0 мл

Фуксин

Карболовый фуксин Циля
ИнгредиентыКол-во
Фуксин основной0,3 г
95% этанол10,0 мл
Фенол кристаллический расплавленный5,0 мл
Дистиллированная вода95,0 мл
  1. Растворить фуксин в спирте
  2. Растворить фенол в воде
  3. Смешать растворы
  4. Выдержать в течение ночи
  5. Фильтровать через грубый фильтр перед использованием
Водный фуксин
  1. Развести карболовый фуксин дистиллированной водой 1:10
  2. Не хранить


Методика окраски

  1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек) 
  3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
  4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить 
  5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
  6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
  7. Промыть и подсушить препарат


Модификация Burke

Красители и реактивы 

Основной краситель

Раствор А
ИнгредиентыКол-во
Кристалвиолет1,0 г
95% этанол100,0 мл
Раствор В
ИнгредиентыКол-во
Двууглекислый натрий1,0 мл
Дистиллированная вода20,0 мл

Протравливающий раствор

ИнгредиентыКол-во
Йод кристаллический1,0 г
Калия йодид2,0 г
Вода дистиллированная100,0 мл
  1. Смешать в ступке кристаллический йод и калия йодид.
  2. Тщательно растереть пестиком.
  3. Добавлять по каплям воду, продолжая растирать смесь до кашицеобразного состояния.
  4. Постепенно добавить оставшуюся воду. Раствор хранить в банке темного стекла с притертой пробкой.

Обесцвечивающий раствор

Вариант 1
ИнгредиентыКол-во
Ацетон10,0 г
Этиловый эфир10,0 мл
Вариант 2
ИнгредиентыКол-во
Ацетон30,0 мл
Этиловый эфир10,0 мл

Дополнительный краситель

ИнгредиентыКол-во
Сафранин-О2,0 г
Дистиллированная вода100,0 мл


Методика окраски

  1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
  2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b. (2-3 мин) 
  3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
  4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить)
  5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
  6. Препарат высушить на воздухе.
  7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек)
  8. Промыть и подсушить препарат


Модификация Kopeloff-Beerman

Красители и реактивы 

Основной краситель

Раствор А
ИнгредиентыКол-во
Кристалвиолет1,0 г
95% этанол100,0 мл
Раствор В
ИнгредиентыКол-во
Двууглекислый натрий1,0 мл
Дистиллированная вода20,0 мл

Протравливающий раствор

ИнгредиентыКол-во
Йод кристаллический2,0 г
1N NaOH (40,1 г/л)10,0 мл
Вода дистиллированная100,0 мл
  1. Растворить йод в 1N растворе едкого натра
  2. Довести дистиллированной водой до 100 мл
  3. Раствор хранить в банке темного стекла с притертой пробкой

Обесцвечивающий раствор

Вариант 1
ИнгредиентыКол-во
Ацетон10,0 г
Этиловый эфир10,0 мл
Вариант 2
ИнгредиентыКол-во
Ацетон30,0 мл
Этиловый эфир10,0 мл

Дополнительный краситель

Водный фуксин
ИнгредиентыКол-во
Фуксин основной0,1 г
Вода дистиллированная100,0 мл


Методика окраски

  1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
  2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более)  
  3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
  4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать
  5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
  6. Препарат высушить на воздухе.
  7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин)
  8. Промыть и подсушить препарат


 

Ошибки

Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

ПричинаРешение

Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)

  1. Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором
  2. Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие
  3. Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску
Старая культураОкраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий - через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста
Культура выращена в неблагоприятных условияхПри выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой Культивируйте микроорганизм на полноценной среде
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)нет


Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет