Атмосфера инкубации

Для успешного культивирования бактерий необходимо создать и поддерживать оптимальные условия, к которым можно отнести:

1.  определенный набор питательных веществ
2. температура инкубации
3. газовая среда определенного состава. , 

Большинство бактерий, с которыми работает лаборатория, относятся к факультативным анаэробам, которые одинаково хорошо растут как при обычной концентрации кислорода, так и при его полном отсутствии. Поэтому как на плотных, так и на жидких средах никакие специальные приемы инкубации применять не нужно. Не нужны никакие действия и при культивировании аэробов на чашечных средах, а вот для жидких сред можно применить специальные приемы:

1. Культивирование в бульоне, налитом тонким слоем в колбу Эрленмейера
2. Культивирование пробирок с бульоном в наклоненном состоянии ("скашивание" для увеличения площади контакта с воздухом)
3. Культивирование в колбах на шуттель-аппарате

  

Замещение воздуха газовой смесью из баллонов

Воздух из анаэростата откачивается при помощи вакуумного насоса. Откачка должна проводиться равномерно и не очень быстро, во-избежание разрушения чашек из-за резкого перепада давления. Давление выравнивается газовой смесью требуемого состава из баллона. Проводится не менее трех циклов «откачка-заполнение» для полного удаления воздуха. При последнем заполнении в анаэростате создается небольшое избыточное давление, предохраняющее от поступления воздуха при незначительной разгерметизации системы.

Этот способ позволяет создавать оптимальную атмосферу инкубации практически мгновенно, однако используется он редко из-за присущих ему существенных недостатков:

1. Газовая смесь, содержащая 10% водорода потенциально взрывоопасна
2. Газовые баллоны требуют особых условий хранения и эксплуатации

Ряд фирм выпускают специальные устройства, призванные упростить и стандартизировать создание газовой среды инкубации методом замещения. В нашей стране зарегистрирована система "Anoxomat  III". Основой ее является насос с процессорным управлением, позволяющий создавать в анаэростате разрежение, контролировать герметичность системы а затем смешивать газы в определенной пропорции. Результат может быть распечатан на принтере в виде "чека" и закреплен на анаэростате, возможно применение штрих-кодирования. Несомненным достоинством является создание оптимальных для микроорганизмов условий в течение нескольких минут. Можно использовать анаэростаты разной вместимости. Однако, врядли "Anoxomat III" станет основным прибором в практической лаборатории. Даже в базовой комплектации его стоимость на сегодняшний день очень высока, невозможно использовать анаэростаты сторонних производителей. Необходимо закупать не только газ в баллонах, но и специальный катализатор, что существенно увеличивает эксплуатационные расходы.

Газогенерирующие пакеты

Сегодня использование химических реакций для генерации газовой атмосферы необходимого состава является рутинной лабораторной процедурой. Все микробиологические фирмы в настоящий момент могут предложить такие продукты.  

Создание повышенной концентрации СО₂

Наиболее простой задачей является создание капнофильной атмосферы. Пакет должен содержать смесь гидрокарбоната натрия (NaHCO₃) и органической кислоты (обычно лимонной). Эту смесь настолько легко приготовить в лабораторных условиях, что тратить деньги на покупку «фирменного» газогенерирующего пакета нет никакого резона. Химизм реакции прост и описывается следующим уравнением:

Н₃С₆Н₅О₇ + 3NaHCO₃ → Na₃C₆H₅O₇ + 3CO₂ + 3H₂O

Исходя из представленного уравнения, лимонная кислота взаимодействует с гидрокарбонатом натрия в соотношении 1: 3, образуя при этом 3 моля углекислого газа, которые при нормальном давлении имеют объем 22,4 • 3 = 67,2 Л. Для создания в анаэростате объемом 2,5 л 10% концентрации углекислого газа необходимо получить примерно 0,250 л СО₂ или 0,011 моля этого вещества. Для этого необходимо иметь 0,004 моля лимонной кислоты и 0,011 моля питьевой соды, или 0,77 г и 0,92 г соответственно. Для простоты эти вещества можно взять в равных количествах - по 1 г. Самодельные СО₂ - генераторы могут быть рассчитаны на любой объем. 

В диагностических наборах для выделения гонококков ('Biocult-GC' Orion Diagnostica и 'Gonoline DUO' BioMerieux) генераторы углекислого газа имеют вид таблеток. Специального увлажнения таблеток не требуется - достаточно влажности воздуха в контейнере.

Микроаэрофилы и анаэробы

Газогенераторы для микроаэрофилов и строгих анаэробов устроены по одному принципу. Различие заключается лишь в том, что для микроаэрофилов реагенты берутся в количествах, позволяющих оставить 5-7% кислорода.

Газогенераторы зарубежного производства по принципу действия подразделяются на каталитические и бескаталитические

Состав  каталитических пакетов входит смесь, необходимая для получения двуокиси углерода и гидроборид натрия. При  увлажнении реагентов образуется углекислый газ и снижается рН среды в пакете. В кислой среде гидроборид натрия разлагается с образованием молекулярного водорода. На катализаторе (платина, палладий, иридий и т.д.) водород реагирует с кислородом воздуха с образованием воды. Катализатор может быть закреплен в специальной корзинке под крышкой анаэростата или вмонтирован прямо в пакет (“GasPak Plus”, BBL)

Бескаталитические пакеты работают без увлажнения и без выделения водорода. Основу этих пакетов составляет аскорбиновая кислота. Реактивы помещены в газопроницаемый бумажный пакет, который в свою очередь помещен в пластиковую герметичную упаковку. Ее вскрытие и соприкосновение реагентов с воздухом запускает химическую реакцию.  

В нашей стране производятся газогенерирующие пакеты «Кампигаз» (для микроаэрофилов) и «Анаэрогаз» (для строгих анаэробов). Фирма не раскрывает состав и принцип действия этих пакетов. Реакционная смесь расфасована в газопроницаемые пакеты (напоминающие чайные пакетики). Химическая реакция запускается увлажнением пакетов. В результате протекающих процессов атмосфера инкубации обогащается углекислым газом и происходит поглощение кислорода. При использовании пакетов «Анаэрогаз» получаемая газовая среда в анаэростате объемом 2,5-3,0 литра содержит: кислорода – менее 0,1%; углекислого газа – 14-16%; водород – 4-6%.

Безусловным достоинством этих пакетов является их относительно низкая стоимость, а во всем, что касается удобства работы – эти пакеты очень далеки от совершенства. Во-первых, пакеты «пылят», пачкая руки и все вокруг, во-вторых, пакет в микранаэростат надо класть в крышке от чашки Петри, поскольку его содержимое при увлажнении вытекает из пакета.

Иногда бывает необходимо инкубировать всего 2-3 чашки. Импортные пакеты, рассчитаны на работу с анаэростатоми определенного объема и разделить эти пакеты на части невозможно. Что касается пакетов «Кампигаз» и «Анаэрогаз», то никто не мешает, вскрыв эти пакеты, разделить их содержимое пропорционально объему используемого для культивирования сосуда. Полученные навески можно расфасовать в «конвертики» из фильтровальной бумаги и использовать по мере надобности.

Свечной сосуд

При горении свечи расходуется кислород, и атмосфера обогащается углекислым газом. Однако, горение свечи прекращается, когда концентрация кислорода еще очень высока (10-13%), и, следовательно, такой способ годится для капнофилов и некоторых микроаэрофилов, но абсолютно не подходит для анаэробов.

Большое значение имеет расположение свечи в анаэростате. Ее надо помещать как можно ближе к крышке. В этом случае образующийся углекислый газ, который тяжелее воздуха, опускаясь вниз, выдавливает воздух в верхнюю часть анаэростата. Горение свечи продолжается дольше, и концентрация кислорода снижается до 10-11%. Дополнительно концентрацию кислорода на 1-2% можно снизить, поместив в анаэростат вату, смоченную раствором медного купороса с завернутыми в нее 2-3 стальными канцелярскими скрепками.

В лабораториях достаточно часто для культивирования микроаэрофилов и капнофилов используют большие эксикаторы. Это самая непригодная для свечного сосуда емкость. Свечу в эксикаторе разместить очень сложно. Поэтому, берут кусок ваты, помещают его между чашками и поджигают (иногда вату смачивают небольшим количеством спирта). Крышку быстро закрывают и притирают. При таком способе возникающее интенсивное объемное горение приводит не столько к выгоранию, сколько к выдавливанию воздуха из эксикатора (как при постановке медицинских банок).

Устройства для культивирования

Анаэробная станция

Для культивирования микроорганизмов могут быть использованы специальные системы типа CO₂ – инкубаторов и анаэробных рабочих станций. Для создания контролируемой атмосферы в этих устройствах используются баллоны с готовой газовой смесью. Анаэробные станции позволяют проводить все виды работ с анаэробами: приготовление и хранение питательных сред, посев исследуемого материала и инкубацию посевов. В анаэробной станции постоянно поддерживаются условия, оптимальные для изучаемых микроорганизмов. Однако, это решение вряд ли можно признать оптимальным для практических лабораторий  из-за высокой стоимости оборудования и расходных материалов.

Микроанаэростат

Микроанаэростаты являются наиболее оптимальным решением для лабораторий, поэтому им уделим больше внимания.

«Классический» анаэростат представляет собой металлический или пластиковый цилиндр объемом 2,5 –  3,5 л. Крышка с герметизирующей прокладкой из вакуумной резины крепится при помощи винтовой стяжки (струбцин).

На крышке имеются один  или несколько штуцеров для откачки воздуха и заполнения анаэростата,  предохранительный клапан, и манометр.

В некоторых лабораториях еще сохранились старые отечественные анаэростаты НПО «Красногвардеец». Они имеют конструктивный недостаток, делающий невозможным их применение – конструкция фланца приводит к «выдавливанию» резиновой прокладки и разгерметизации устройства. Чем сильнее притягивается крышка, тем больше выдавливается прокладка.

Разработанный во ВНИКИ МЛТ анаэростат АЭ-01 имеет удобную и надежную систему герметизации. В отличие от аналогичных импортных приборов он рассчитан на работу со стеклянными чашками диаметром 100 мл, наиболее широко используемыми в отечественных лабораториях.

На крышке имеются  штуцеры, к одному из которых может быть подсоединен входящий в комплект манометр.

В настоящее время в практических лабораториях  наибольшее распространение получили упрощенные микроанаэростаты, не имеющие манометров и вентилей на крышке и используемые только с газогенерирующими пакетами. Это позволило значительно упростить систему фиксации крышки. Одной и знаиболее интересных моделей этой группы является анаэростат BioMerieux (напоминающийскорее бытовой контейнер для микроволновой печи), который очень удобен в работе.

Приспособленные емкости

Здесь выбор практически безграничен. Наиболее удобными «анаэростатами» этойкатегории являются бытовые контейнеры для пищевых продуктов. Главное, чтобы эти контейнеры имели герметизирующую прокладку. Эти  контейнеры, как и анаэростат BioMerieux, могут использоваться только с газогенерирующими пакетами. При работе с импортными газогенераторами необходимо подбирать контейнер соответствующего объема. При работе с отечественными пакетами объем не имеет существенного значения

Можно использовать стеклянные консервные банки с закручивающейся крышкой, полиэтиленовые пакеты, эксикаторы и  любые другие емкости, закрывающиеся герметично. Любой выбор имеет своидостоинства и недостатки.