Гидролиз гиппурата

Теория

Гидролиз гиппурата используется для предварительной идентификации Gardnerella vaginalis, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes  и стрептококков группы В. Разрушение пептидной связи приводит к образованию бензойной кислоты и глицина

В классическом варианте гидролиз определяют по продукции бензойной кислоты, используя в качестве индикатора хлорид железа (III). При этом образуется преципитат и осадок бензоата железа коричневого цвета. Этот метод достаточно чувствителен и специфичен, однако требует продолжителной инкубации (48 часов).

В настоящее время чаще используется ускоренный метод определения гидролиза гиппурата, основанный на выявлении глицина в цветной реакции с нингидрином. Это быстрый и простой метод, однако нингидрин может давать цветную реакцию с любой аминокислотой.

Методы постановки

Тест с хлоридом железа

  1. Диск с гиппуратом (HiMedia, Fluka или других производителей) асептически поместить в пробирку с сердечно-мозговым бульоном
  2. Инокулировать бульон чистой культурой изучаемого микроорганизма
  3. Инкубировать 48 часов в подходящих условиях.
  4. Осадить клетки центрифугированием
  5. 2 мл надосадочной жидкости перенести в другую пробирку
  6. Добавить 2 мл раствора  хлорида железа  и тщательно перемешать.

В случае положительного результата в течение 10 минут должен образоваться коричневый осадок бензоата железа

Тест с нингидрином

  1. Пробирку с раствором  гиппурата натрия вынуть из морозильника и нагреть до комнатной температуры.
  2. Чистую культуру изучаемых бактерий суспендировать в растворе до получения густой суспензии
  3. Инкубировать пробирку 2 часа при 37 0С.
  4. Аккуратно добавить 0,2 мл раствора  нингидрина. Раствор добавлять по стенке пробирки.
    НЕ ПЕРЕМЕШИВАТЬ РЕАГЕНТЫ!
  5. Инкубировать 10 мин при 37 0С.

Учет результата

В случае положительного результата неводная (верхняя) фракция интенсивно окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Отсутствие окраски или слабое фиолетове окрашивание расценивается как отрицательный результат. Слабое окрашивание может  быть связано с недостаточной концентрацией бактериальной суспензии. 

Интенсивная окраска всей реакционной смеси, как правило, свидетельствует о ложноположительном результате и  связана с  неспецифическим взаимодействием нингидрина с аминокислотами. Такой же результат может наблюдаться и при резко положительной реакции - за 10 минут окраска распространяется и на водную (нижнюю) фракцию. Для того, чтобы отличить ложноположительную и резко положительную реакции необходимо после добавления реактива проводить учет  каждые 2-3 минуты.


611 05.08.2020