Каталаза

Немного истории

Каталаза – один из главных ферментов защиты бактериальной клетки от повреждения ее структур перекисью водорода. Одним из основных источников перекиси водорода является окислительное фосфорилирование с использованием кислорода в качестве конечного акцептора электронов. При этом образуется не только вода, но и «активные формы кислорода – перекись водорода, супероксид-ион, синглетный кислород. Возможно концентрация каталазы в бактериальной клетке может коррелировать с ее вирулентностью.

Изучение биохимических свойств микроорганизмов является одним из ключевых методов идентификации микроорганизмов и каталаза была одним из первых определяемых ферментов (с 1893 года). Сначала постановка теста была очень громоздкой и требовала специального оборудования. Совершенствование в течение многих лет позволило значительно упростить процедуру и сегодня это один из самых простых тестов.

Теория

Каталаза нейтрализует перекись водорода, разлагая ее с образованием воды и молекулярного кислорода, выделяющегося в виде пузырьков газа.

2H2O2 → 2H2O + O2

Методы постановки

В большинстве случаев для проведения реакции используется 3% раствор перекиси водорода. Однако при идентификации облигатно анаэробных бактерий необходим 15% раствор, а для определения супероксид дисмутазы (superoxol test) - 30% раствор, т.е. практически концентрированный раствор перекиси водорода. Раствор должен храниться в холодильнике в упаковке, исключающей воздействие света.

Тест на предметном стекле

  1. На сухое чистое предметное стекло нанести полную петлю агаровой культуры. При использовании культуры с кровяного агара нельзя допускать попадания кусочков среды на стекло, поскольку эритроциты вызовут ложноположительную реакцию.
  2. Нанести на культуру 1 каплю 3% раствора перекиси водорода. Реактив можно нанести на стекло рядом с культурой, а затем перемешать зубочисткой
  3. При положительном результате пузырьки газа появятся практически мгновенно, вызывая "вскипание" реактива. Позднее образование пузырьков, а также их малое количество могут свидетельствовать о ложноположительном результате. Поэтому мы не рекомендуем накрывать тест покровным стеклом и, тем более проводить учет при малом увеличении микроскопа для учета "слабоположительных" результатов

Ошибкой является внесение культуры в каплю перекиси при помощи металлической петли или иглы, поскольку металл может вызвать ложноположительный результат. При необходимости культуру можно внести при помощи стерильной зубочистки или одноразовой пластиковой петли.

Пробирочный тест

Вариант 1.

 

  1. Thumbnail imageВ чистую сухую пробирку внести 4-5 капель 3% раствора перекиси водорода (при использовании микропробирок - 1-2 капли).
  2. Деревянной палочкой (зубочисткой) снять с агара колонию и опустить в реактив. При использовании культуры с кровяного агара нельзя допускать попадания кусочков среды, поскольку эритроциты вызовут ложноположительную реакцию.
  3. При положительном результате появятся пузырьки газа.

Этот метод особенно рекомендован при высоком риске внутрилабораторного заражения, а также при работе с перекисью водорода высокой концентрации (15-30%). Пробирка снижает риск образования аэрозоля.

Вариант 2. (бульонная культура)

  1. В пробирку с бульонной культурой внести 2-3 капли 3% раствора перекиси водорода
  2. В случае положительного результата образование пузырьков газа вызовет вспенивание среды

Метод применяется редко, поскольку не имеет преимуществ перед предыдущими. Кроме того, если бульонная культура будет смешанной, мы можем получить ложноположительный результат.

Вариант 3. (скошенный агар)

 

  1. Thumbnail imageВ пробирку с обильным ростом культуры на скошенном агаре внести 4-5 капель 3% раствора перекиси водорода
  2. В случае положительного результата образуются пузырьки газа

Метод применяется редко, поскольку не имеет преимуществ перед предыдущими.

Чашечный тест

  1. На колонии на чашке наносят одну каплю 3% раствора перекиси водорода
  2. В случае положительного результата образуются пузырьки газа

Данный метод не может быть использован при росте культуры на кровяном агаре.

Cупероксид дисмутаза (Superoxol test)

Superoxol test ставится с 30% перекисью водорода и считается положительным, если бурное выделение газа начинается через 1-2 секунды. Отсутствие пузырьков или их появление после третьей секунды расценивается как отрицательный результат. Супероксид дисмутаза обнаруживается у всех штаммов N.gonorrhoaeae и у большинства нейссерий, но не у N.meningitidis.


  


652 13.08.2020